BÀI 6: KỸ THUẬT NUÔI CẤY VÀ GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT

1. KỸ THUẬT CẤY TRUYỀN VI SINH VẬT

1.1. Mục đích

• Duy trì sự sống: Chuyển vi sinh vật từ môi trường đã cạn kiệt dinh dưỡng sang môi trường mới để chúng tiếp tục phát triển.

• Nhân giống: Tăng số lượng tế bào vi sinh vật phục vụ cho các thí nghiệm định lượng hoặc sản xuất.

• Làm sạch giống: Kết hợp cấy truyền với các thao tác phân lập để đảm bảo độ thuần khiết của chủng giống.

• Nghiên cứu đặc tính: Quan sát sự thay đổi của vi sinh vật khi tiếp xúc với các điều kiện môi trường khác nhau.

1.2. Quy trình cấy truyền vi sinh vật

Tùy vào trạng thái môi trường (lỏng sang lỏng, đặc sang đặc, hoặc đặc sang lỏng), quy trình chung gồm các bước:

1. Chuẩn bị: Khử trùng khu vực làm việc, chuẩn bị đèn cồn, que cấy (vòng hoặc thẳng), ống nghiệm chứa môi trường mới.

2. Khử trùng dụng cụ: Đốt nóng đỏ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn.

3. Mở ống nghiệm: Dùng ngón út và áp út của bàn tay cầm que cấy để mở nút bông ống nghiệm (không đặt nút bông xuống bàn). Hơ nóng miệng ống nghiệm.

4. Lấy mẫu: Dùng que cấy lấy một ít dịch khuẩn hoặc khuẩn lạc từ ống nghiệm giống.

5. Cấy mẫu: Cho que cấy vào ống nghiệm môi trường mới.

   • Môi trường lỏng: Khuấy nhẹ que cấy vào dịch.

   • Môi trường thạch nghiêng: Cấy theo đường ziczac từ dưới lên trên.

   • Môi trường thạch đứng: Cấy đâm xuyên vào lòng thạch.

6. Kết thúc: Hơ nóng miệng ống nghiệm, đậy nút bông, tiệt trùng que cấy và ghi nhãn (tên giống, ngày cấy).

1.3. Ứng dụng trong nghiên cứu điều kiện sống của vi sinh vật

Mục đích là xác định giới hạn chịu đựng và điều kiện tối ưu để vi sinh vật phát triển.

1.3.1. Cấy truyền trong các điều kiện khác nhau về độ pH

• Cách thực hiện: Chuẩn bị các dãy ống nghiệm có môi trường dinh dưỡng được điều chỉnh pH khác nhau (ví dụ: pH 3, 5, 7, 9).

• Quan sát: Sau khi ủ, so sánh độ đục (đối với môi trường lỏng) hoặc kích thước khuẩn lạc (đối với môi trường đặc) để xác định khoảng pH tối ưu cho vi sinh vật đó.

1.3.2. Cấy truyền trong các điều kiện khác nhau về nồng độ (Áp suất thẩm thấu/Muối)

• Cách thực hiện: Sử dụng môi trường có nồng độ muối ($NaCl$) khác nhau (ví dụ: 0.5%, 3%, 5%, 10%).

• Ứng dụng: Giúp phân biệt các loài vi sinh vật ưa muối (halophilic) và các loài không chịu được nồng độ thẩm thấu cao. Thường dùng trong kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm muối chua hoặc thủy sản.

2. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT

Để bảo tồn giống vi sinh vật trong thời gian dài mà không làm thay đổi đặc tính di truyền, các phương pháp sau thường được sử dụng:

• Phương pháp cấy chuyền định kỳ (Subculturing):

  • Là phương pháp đơn giản nhất. Vi sinh vật được cấy vào môi trường thạch nghiêng, sau khi mọc sẽ được bảo quản trong tủ lạnh ($4^{\circ}C - 10^{\circ}C$).

  • Thời gian: Phải cấy chuyền lại sau mỗi 1-3 tháng.

• Bảo quản dưới lớp dầu khoáng (Paraffin):

  • Phủ một lớp dầu Paraffin đã tiệt trùng lên bề mặt thạch nghiêng đã có vi sinh vật mọc. Lớp dầu giúp hạn chế sự bay hơi nước và giảm quá trình trao đổi chất.

  • Thời gian: Có thể giữ từ 6 tháng đến 1 năm.

• Phương pháp đông băng (Glycerol stock):

  • Hòa tan vi sinh vật vào dung dịch có chứa chất bảo vệ tế bào (thường là Glycerol 15-20%) rồi đem giữ ở nhiệt độ thấp ($-20^{\circ}C$ đến $-80^{\circ}C$).

  • Thời gian: Giữ được nhiều năm.

• Phương pháp đông khô (Lyophilization):

  • Làm khô vi sinh vật ở trạng thái đông băng trong môi trường chân không. Tế bào ở dạng bột khô, đựng trong ống thủy tinh hàn kín.

  • Thời gian: Đây là phương pháp tối ưu nhất, có thể giữ giống trên 10 năm.