BÀI 9: KỸ THUẬT NUÔI CẤY VÀ GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT

1. Kỹ thuật cấy truyền vi sinh vật

1.1. Mục đích

• Duy trì sự sống: Chuyển vi sinh vật (VSV) từ môi trường đã cạn kiệt dinh dưỡng sang môi trường mới để tiếp tục sinh trưởng.

• Nhân giống: Tạo ra lượng lớn sinh khối vi sinh phục vụ cho các thí nghiệm hoặc ứng dụng vào bể xử lý.

• Kiểm tra tính thuần khiết: Đảm bảo chủng vi sinh không bị nhiễm tạp sau một thời gian lưu trữ.

1.2. Quy trình cấy truyền vi sinh vật (Cấy từ thạch nghiêng sang thạch nghiêng)

1. Chuẩn bị: Ống nghiệm chứa giống cũ, ống nghiệm chứa môi trường mới (thạch nghiêng), đèn cồn và que cấy.

2. Khử trùng: Đốt đỏ que cấy, đồng thời hơ nhẹ miệng hai ống nghiệm qua ngọn lửa đèn cồn.

3. Lấy giống: Dùng que cấy đã nguội khều nhẹ một ít sinh khối VSV từ ống giống cũ.

4. Cấy truyền: Đưa que cấy vào ống môi trường mới, ria nhẹ nhàng trên bề mặt thạch theo hình zig-zag từ dưới lên trên.

5. Kết thúc: Hơ nóng lại miệng ống nghiệm, đậy nút bông và khử trùng que cấy.

1.3. Ứng dụng trong nghiên cứu điều kiện sống của vi sinh vật

Cấy truyền là công cụ để thực hiện các thí nghiệm khảo sát đặc tính sinh học của VSV:

1.3.1. Cấy truyền môi trường dinh dưỡng trong các điều kiện khác nhau về độ pH

• Cách thực hiện: Chuẩn bị một dãy ống nghiệm có cùng thành phần môi trường nhưng thay đổi pH (ví dụ: pH 3, 5, 7, 9).

• Mục đích: Xác định dải pH tối ưu cho VSV phát triển. Đối với xử lý nước thải, việc này giúp xác định ngưỡng chịu đựng của vi khuẩn trước các dòng thải axit hoặc kiềm.

1.3.2. Cấy truyền môi trường dinh dưỡng trong các điều kiện khác nhau về nồng độ (Độ mặn/Chất ô nhiễm)

• Cách thực hiện: Chuẩn bị môi trường có nồng độ muối ($NaCl$) hoặc nồng độ chất ô nhiễm (như Kim loại nặng, Phenol) tăng dần.

• Mục đích: Đánh giá khả năng chống chịu và phân hủy chất độc của vi sinh vật. Sinh viên sẽ quan sát độ đục hoặc kích thước khuẩn lạc để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).

2. Phương pháp giữ giống vi sinh vật

Sau khi đã có chủng thuần khiết, việc giữ giống nhằm đảm bảo VSV sống sót lâu nhất với sự thay đổi đặc tính di truyền là ít nhất.

• Phương pháp cấy truyền định kỳ (Lưu giữ ngắn hạn):

  • VSV được cấy trên thạch nghiêng, nuôi ủ cho phát triển rồi bảo quản trong tủ lạnh ($4 - 10^{\circ}C$).

  • Ưu điểm: Đơn giản, dễ thực hiện tại phòng Lab trường.

  • Nhược điểm: Phải cấy truyền lại sau 1-3 tháng, dễ bị nhiễm hoặc biến đổi gen.

• Phương pháp bảo quản dưới lớp dầu khoáng:

  • Phủ một lớp dầu Paraffin vô trùng lên bề mặt thạch nghiêng đã có VSV mọc. Lớp dầu ngăn cản sự bay hơi nước và hạn chế oxy hóa.

  • Thời gian giữ giống: 6 tháng - 2 năm.

• Phương pháp giữ giống trong glycerol (Trữ đông):

  • Dịch vi sinh được trộn với Glycerol nồng độ 20-30% và bảo quản ở nhiệt độ $-20^{\circ}C$ hoặc $-80^{\circ}C$. Glycerol đóng vai trò chất bảo vệ tế bào không bị phá vỡ bởi tinh thể đá.

  • Đây là phương pháp phổ biến để lưu giữ các chủng vi khuẩn xử lý môi trường quan trọng.

• Phương pháp đông khô (Long-term storage):

  • VSV được làm khô ở trạng thái đóng băng trong chân không. Đây là phương pháp tốt nhất để giữ giống ổn định hàng chục năm nhưng đòi hỏi thiết bị đắt tiền.