Nội dung

BÀI 10: KIỂM NGHIỆM TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ (APC - Aerobic Plate Count)

7.1. Mục đích

  • Đánh giá mức độ ô nhiễm: Xác định tổng số vi sinh vật sống sót, có khả năng hình thành khuẩn lạc trong điều kiện hiếu khí ở nhiệt độ và thời gian nuôi cấy xác định.

  • Kiểm soát vệ sinh: Kiểm tra hiệu quả của các quá trình khử trùng, vệ sinh công nghiệp trong nhà máy hoặc hiệu quả xử lý của các công trình xử lý nước thải sinh học.

  • Tiêu chuẩn chất lượng: Đối chiếu với các quy chuẩn Việt Nam (QCVN) về chất lượng nước đầu ra hoặc an toàn vệ sinh môi trường.

7.2. Quy trình phân tích (Phương pháp đổ đĩa - Pour Plate)

Tại phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Hóa – Môi trường, chúng ta thực hiện theo các bước chuẩn sau:

Bước 1: Chuẩn bị mẫu và pha loãng

  • Thực hiện pha loãng mẫu theo dãy thập phân ($10^{-1}, 10^{-2}, 10^{-3}...$) như đã học ở Bài 7 để đảm bảo mật độ vi khuẩn trên đĩa sau khi mọc nằm trong khoảng dễ đếm (30 - 300 khuẩn lạc).

Bước 2: Cho mẫu vào đĩa Petri

  • Dùng pipette vô trùng hút 1ml dịch mẫu ở mỗi nồng độ pha loãng cho vào tâm của đĩa Petri vô trùng tương ứng (mỗi nồng độ thực hiện 2 đĩa lặp lại).

Bước 3: Đổ môi trường

  • Rót khoảng 15ml môi trường PCA (Plate Count Agar) hoặc NA (Nutrient Agar) đã được nóng chảy và để nguội đến $45-50^{\circ}C$ vào đĩa đã có mẫu.

  • Xoay tròn đĩa nhẹ nhàng theo cả hai chiều (thuận và ngược chiều kim đồng hồ) để mẫu và môi trường hòa trộn đều.

Bước 4: Nuôi ủ

  • Đợi thạch đông đặc, lật ngược đĩa và cho vào tủ ấm.

  • Nhiệt độ: $30^{\circ}C \pm 1^{\circ}C$ hoặc $37^{\circ}C \pm 1^{\circ}C$.

  • Thời gian: $48 \pm 3$ giờ.

[Image: Pour plate technique steps: sample addition, agar pouring, mixing, and incubation]

7.3. Đọc kết quả phân tích

Sau thời gian nuôi ủ, sinh viên tiến hành đếm tất cả các khuẩn lạc mọc trên bề mặt và trong lòng môi trường thạch.

a. Nguyên tắc chọn đĩa để đếm:

  • Chỉ chọn các đĩa có số lượng khuẩn lạc nằm trong khoảng từ 30 đến 300.

  • Nếu đĩa có quá 300 khuẩn lạc: Ghi "Quá nhiều không đếm được" (TNTC - Too Numerous To Count).

  • Nếu đĩa có ít hơn 30 khuẩn lạc: Ghi số đếm được nhưng kết quả chỉ mang tính chất ước lượng.

b. Công thức tính toán:

Mật độ vi khuẩn hiếu khí trong 1ml mẫu gốc ($N$) được tính theo công thức:

$$N (CFU/ml) = \frac{\sum C}{(n_1 \times 1 + n_2 \times 0.1) \times d}$$

Trong đó:

  • $\sum C$: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn.

  • $n_1$: Số lượng đĩa tại độ pha loãng thứ nhất.

  • $n_2$: Số lượng đĩa tại độ pha loãng kế tiếp.

  • $d$: Hệ số pha loãng của độ pha loãng thứ nhất.

Đơn vị tính: CFU/ml (Colony Forming Units - Đơn vị hình thành khuẩn lạc).

c. Báo cáo kết quả:

  • Nếu kết quả lẻ, làm tròn đến hai chữ số có nghĩa (ví dụ: $1.5 \times 10^4 CFU/ml$).

  • Ghi chú về hình thái khuẩn lạc chiếm ưu thế (màu sắc, kích thước) để đánh giá sơ bộ hệ vi sinh vật trong mẫu.

HƯỚNG DẪN TỔNG KẾT THỰC HÀNH (Dành cho sinh viên HueIC)

  1. Đối chiếu: Lấy kết quả tổng vi khuẩn hiếu khí vừa tính được so sánh với tiêu chuẩn cho phép (Ví dụ: QCVN 08-MT:2015/BTNMT về chất lượng nước mặt).

  2. Thảo luận: Nếu tổng số vi khuẩn vượt ngưỡng quá cao, em hãy đề xuất các biện pháp tăng cường khử trùng (Dùng Clo, UV hoặc Ozone).

  3. Vệ sinh: Sau khi đọc kết quả, toàn bộ đĩa Petri phải được hấp tiệt trùng trong nồi hấp AutoClave trước khi đổ bỏ thạch và rửa dụng cụ để đảm bảo vệ sinh môi trường trường học.