BÀI 8: KỸ THUẬT NHUỘM GRAM

5.1. Mục đích của nhuộm Gram

Nhuộm Gram là phương pháp nhuộm phân biệt (differential staining) phổ biến nhất, nhằm:

Phân loại vi khuẩn: Chia vi khuẩn thành hai nhóm: Gram dương (Gram+ ) và Gram âm (Gram- ).
Quan sát hình thái: Xác định rõ hình dạng (cầu, que, xoắn), kích thước và cách sắp xếp của vi khuẩn.
Ứng dụng trong xử lý môi trường: Giúp xác định thành phần ưu thế trong bùn hoạt tính (ví dụ: vi khuẩn Gram âm thường chiếm ưu thế trong các hệ thống Aerotank hoạt động tốt).

Quy trình gồm 4 bước nhuộm chính sau khi đã chuẩn bị tiêu bản cố định (đã dàn mẫu, để khô và hơ nóng trên ngọn lửa):

Bước 1: Nhuộm màu chính (Tím tinh thể)

Bước 2: Cố định màu (Dung dịch Lugol)

Nhỏ dung dịch Lugol phủ kín tiêu bản trong 1 phút. Dung dịch này tạo phức chất Tím tinh thể - Iodine bền vững trong tế bào.
Rửa nhẹ bằng nước cất.
Kết quả: Tất cả vi khuẩn vẫn giữ màu tím đậm.

Bước 3: Tẩy màu (Cồn $90^{\circ}$)

Nhỏ cồn lên tiêu bản và nghiêng lam kính cho đến khi dòng cồn chảy ra không còn màu tím (thường từ 10 - 30 giây, tùy độ dày vết dàn). Đây là bước quan trọng nhất.
Rửa ngay bằng nước cất để dừng quá trình tẩy màu.
Kết quả: Vi khuẩn Gram+ giữ màu tím; vi khuẩn Gram- bị mất màu (trở nên trong suốt).

Bước 4: Nhuộm bổ sung (Safranin/Fuchsin)

Đặc điểm	Vi khuẩn Gram dương (Gram+)	Vi khuẩn Gram âm (Gram-)
Màu sắc	Màu tím hoặc tím xanh	Màu đỏ hoặc hồng
Cấu tạo vách	Vách dày, chứa nhiều Peptidoglycan	Vách mỏng, có lớp màng Lipopolysaccharide bên ngoài
Ví dụ	Staphylococcus, Bacillus...	E. coli, Salmonella, Pseudomonas...

Thời gian tẩy cồn: Nếu tẩy quá lâu, vi khuẩn Gram+ có thể bị mất màu và trông giống Gram-. Nếu tẩy quá nhanh, vi khuẩn Gram- vẫn còn màu tím.
Tuổi của vi khuẩn: Nên nhuộm các chủng vi khuẩn được nuôi cấy từ 18-24 giờ. Vi khuẩn quá già có thể thay đổi tính chất bắt màu Gram.
Độ dày tiêu bản: Vết dàn mẫu phải mỏng và đều để hóa chất thấm tốt vào từng tế bào.