Nội dung

BÀI 7: QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT

1. Cấu tạo và hướng dẫn sử dụng kính hiển vi

Tại phòng Lab của Khoa, chúng ta sử dụng kính hiển vi quang học trường sáng.

  • Cấu tạo chính:

    • Hệ thống phóng đại: Thị kính (10x), vật kính (10x, 40x, 100x - vật kính dầu).

    • Hệ thống chiếu sáng: Đèn Halogen/LED, tụ quang, màn chắn sáng.

    • Hệ thống cơ học: Bàn để tiêu bản, ốc sơ cấp (macromet), ốc thứ cấp (micromet).

  • Hướng dẫn sử dụng:

    1. Đặt tiêu bản lên bàn kính, cố định bằng kẹp.

    2. Dùng vật kính 10x để tìm vùng có mẫu.

    3. Chuyển sang 40x để quan sát rõ hơn.

    4. Soi dầu (100x): Nhỏ 1 giọt dầu soi (Cedrus) lên tiêu bản, nâng bàn kính cho dầu tiếp xúc vật kính 100x. Chỉ dùng ốc vi cấp để lấy nét.

2. Phương pháp làm tiêu bản

  • Tiêu bản soi tươi: Dùng để quan sát sự di động và hình dạng tự nhiên. Nhỏ một giọt dịch vi sinh lên lam kính, đậy lamen sao cho không có bọt khí.

  • Tiêu bản cố định: Dùng để nhuộm màu.

    1. Dàn mẫu: Dàn một giọt dịch vi sinh mỏng trên lam kính.

    2. Để khô tự nhiên.

    3. Cố định: Hơ nhẹ lam kính qua ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để protein đông tụ, giúp vi khuẩn gắn chặt vào lam kính và dễ bắt màu nhuộm.

3. Nhuộm màu tiêu bản cố định (Phương pháp nhuộm đơn)

Nhuộm đơn giúp quan sát rõ hình thái (cầu, que, xoắn) và cách sắp xếp của vi khuẩn.

  • Quy trình:

    1. Nhỏ thuốc nhuộm (Xanh Methylen hoặc Fuchsin đỏ) phủ kín vết dàn mẫu.

    2. Để yên trong 1 - 2 phút.

    3. Rửa nhẹ dưới vòi nước chảy chậm cho đến khi nước rửa không còn màu.

    4. Thấm khô và quan sát dưới vật kính dầu 100x.

4. Kỹ thuật tạo dịch tế bào và phương pháp đếm tế bào

4.1. Tạo dịch tế bào nuôi cấy

Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc trên đĩa Petri (Bài 6) cho vào ống nghiệm chứa nước muối sinh lý ($NaCl$ 0.85%) vô trùng. Lắc đều bằng máy Vortex để tế bào phân tán đồng nhất, tạo thành dịch huyền phù.

4.2. Tạo các dung dịch pha loãng (Pha loãng bậc 10)

Để đếm được tế bào, cần pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp (thường là $10^{-3}$ đến $10^{-6}$).

  • Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng.

  • Hút 1ml dịch gốc cho vào ống 1 $\rightarrow$ được nồng độ $10^{-1}$.

  • Hút 1ml từ ống 1 cho vào ống 2 $\rightarrow$ được nồng độ $10^{-2}$. Tiếp tục cho đến nồng độ mong muốn.

    • Shutterstock

4.3. Đếm bằng buồng đếm NEUBAUER

Đây là phương pháp đếm trực tiếp dưới kính hiển vi để xác định mật độ tế bào trong 1ml dịch mẫu.

  • Cấu tạo buồng đếm: Là một lam kính dày có lưới kẻ gồm 9 ô lớn. Ô giữa (để đếm VSV kích thước nhỏ) chia thành 25 ô trung bình, mỗi ô trung bình lại chia thành 16 ô nhỏ. Tổng cộng ô giữa có $25 \times 16 = 400$ ô nhỏ.

  • Cách thực hiện:

    1. Đậy lamen lên buồng đếm. Nhỏ mẫu vào khe hở để dịch tự tràn vào bề mặt lưới kẻ.

    2. Để yên 3-5 phút cho tế bào lắng xuống.

    3. Soi dưới vật kính 40x, đếm số lượng tế bào trong các ô quy định (thường đếm ở 5 ô trung bình nằm ở 4 góc và 1 ô ở giữa).

  • Công thức tính:

    $$N (tế bào/ml) = \frac{A \times 4000 \times 10^3 \times f}{n}$$

    • $A$: Tổng số tế bào đếm được.

    • $n$: Tổng số ô nhỏ đã đếm.

    • $f$: Hệ số pha loãng mẫu.