BÀI 7: KIỂM NGHIỆM TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ (APC - Aerobic Plate Count)

7.1. MỤC ĐÍCH

• Đánh giá mức độ vệ sinh: Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc) có khả năng phát triển trong điều kiện có oxy ở nhiệt độ xác định.

• Kiểm tra chất lượng thực phẩm: Chỉ số này phản ánh mức độ tươi mới, điều kiện bảo quản và thời hạn sử dụng của sản phẩm.

• Theo dõi quy trình sản xuất: Giúp đánh giá hiệu quả của quá trình khử trùng, vệ sinh nhà xưởng tại các đơn vị sản xuất thực phẩm.

7.2. QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

Quy trình thực hiện theo phương pháp đổ đĩa (Pour plate method) truyền thống.

1. Chuẩn bị mẫu và pha loãng

• Chuẩn bị mẫu: Cân chính xác 10g (mẫu rắn) hoặc đong 10ml (mẫu lỏng) cho vào túi tiệt trùng hoặc bình tam giác có chứa 90ml dung dịch pha loãng (nước muối sinh lý vô trùng hoặc đệm Peptone). Ta thu được nồng độ $10^{-1}$.

• Đồng nhất mẫu: Sử dụng máy dập mẫu hoặc lắc đều để giải phóng vi sinh vật từ mẫu vào dung dịch.

• Dãy pha loãng: Thực hiện pha loãng bậc 10 (như đã học ở Bài 4) đến các nồng độ dự kiến phù hợp ($10^{-2}, 10^{-3}, 10^{-4}, \dots$).

2. Thao tác đổ đĩa

• Dùng Pipette vô trùng hút 1ml dịch mẫu ở mỗi nồng độ pha loãng cho vào tâm của đĩa Petri vô trùng (mỗi nồng độ thực hiện 2 đĩa lặp).

• Rót khoảng 12-15ml môi trường PCA (Plate Count Agar) đã đun chảy và để nguội đến $45^{\circ}C$ vào đĩa.

• Lắc trộn: Xoay đĩa Petri nhẹ nhàng theo hình số 8 (5-10 lần) để dịch mẫu và môi trường hòa trộn đều. Để thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng ngang.

3. Nuôi ủ

• Lật ngược đĩa thạch để tránh nước ngưng tụ rơi xuống bề mặt.

• Cho vào tủ ấm ở nhiệt độ $30^{\circ}C$ (hoặc $37^{\circ}C$ tùy quy chuẩn) trong thời gian 48 giờ $\pm$ 3 giờ.

7.3. ĐỌC KẾT QUẢ PHÂN TÍCH

1. Đếm khuẩn lạc

• Chọn các đĩa có số lượng khuẩn lạc nằm trong khoảng từ 30 đến 300 khuẩn lạc.

• Nếu đĩa có số lượng > 300: Ghi nhận là "Quá dày để đếm" (TNTC - Too Numerous To Count).

• Nếu đĩa < 30: Ghi nhận số lượng thực tế nhưng lưu ý khi tính toán.

2. Công thức tính toán

Số lượng vi khuẩn trong 1g hoặc 1ml mẫu ($N$) được tính theo công thức:

Trong đó:

• $\sum C$: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa đã chọn.

• $n_1$: Số lượng đĩa ở độ loãng thứ nhất.

• $n_2$: Số lượng đĩa ở độ loãng thứ hai.

• $d$: Hệ số pha loãng của độ loãng thứ nhất.

3. Cách ghi kết quả

• Kết quả được ghi dưới dạng số thập phân nhân với lũy thừa của 10 (Ví dụ: $2.5 \times 10^5$ CFU/g).

• Đơn vị tính: CFU/g (đối với mẫu rắn) hoặc CFU/ml (đối với mẫu lỏng).

Lưu ý của giảng viên: * Khi đổ đĩa, nhiệt độ môi trường thạch rất quan trọng: Nếu quá nóng ($> 50^{\circ}C$) sẽ làm chết vi sinh vật; nếu quá nguội thạch sẽ đông vón cục, không trộn đều được mẫu.

• Sinh viên cần quan sát kỹ để phân biệt khuẩn lạc với các hạt mẫu thực phẩm sót lại.