Nội dung

BÀI 5: KỸ THUẬT NHUỘM GRAM

1.1. MỤC ĐÍCH CỦA NHUỘM GRAM

  • Phân loại vi khuẩn: Chia vi khuẩn thành hai nhóm: Gram dương (Gram+ ) và Gram âm (Gram- ).

    • Gram dương: Có lớp peptidoglycan dày, giữ được màu tím của tinh thể tím khi tẩy cồn.

    • Gram âm: Có lớp peptidoglycan mỏng và lớp màng ngoài lipopolysaccharide, bị mất màu tím khi tẩy cồn và ăn màu đỏ của thuốc nhuộm bổ sung.

  • Quan sát hình thái: Xác định rõ hình dạng (cầu khuẩn, trực khuẩn, phẩy khuẩn...) và cách sắp xếp (đứng riêng lẻ, chuỗi, chùm, đôi...).

  • Hỗ trợ định danh: Là bước đầu tiên và bắt buộc trong quy trình định danh vi khuẩn trong thực phẩm và bệnh phẩm.

1.2. THIẾT BỊ DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT CẦN THIẾT

Để thực hiện kỹ thuật này, sinh viên cần chuẩn bị đầy đủ các danh mục sau:

  • Thiết bị: * Kính hiển vi quang học (có vật kính 100x).

    • Đèn cồn.

  • Dụng cụ:

    • Lam kính sạch, que cấy vòng, giá nhuộm, bình tia nước cất, giấy thấm.

  • Bộ thuốc nhuộm Gram:

    1. Dung dịch thuốc nhuộm chính: Tinh thể tím (Crystal Violet).

    2. Dung dịch cố định màu (Chất gắn màu): Dung dịch Lugol (Iodine).

    3. Dung dịch tẩy màu: Cồn tuyệt đối ($90^{\circ} - 95^{\circ}$) hoặc hỗn hợp cồn-aceton.

    4. Dung dịch nhuộm bổ sung (Nhuộm tương phản): Safranin hoặc Fuchsin đỏ.

1.3. QUY TRÌNH CỦA KỸ THUẬT NHUỘM GRAM

Sinh viên thực hiện tuần tự theo 4 bước cơ bản sau khi đã làm tiêu bản cố định (dàn mẫu, để khô, hơ lửa):

  • Bước 1: Nhuộm chính

    • Phủ dung dịch Crystal Violet lên tiêu bản, để yên trong 1 phút.

    • Rửa nhẹ dưới vòi nước cất.

    • Kết quả: Tất cả vi khuẩn đều có màu tím.

  • Bước 2: Gắn màu

    • Phủ dung dịch Lugol lên tiêu bản, để yên trong 1 phút. Lugol tạo phức chất với tím tinh thể bên trong tế bào.

    • Rửa nhẹ bằng nước cất.

    • Kết quả: Phức hợp tím - iod làm màu tím đậm hơn và bền hơn.

  • Bước 3: Tẩy màu (Bước quan trọng nhất)

    • Nhỏ Cồn $90^{\circ}$ lên tiêu bản (nghiêng lam kính), nhỏ từng giọt cho đến khi dòng cồn chảy ra vừa trong (thường khoảng 10 - 30 giây tùy độ dày tiêu bản).

    • Rửa ngay bằng nước cất để dừng quá trình tẩy màu.

    • Kết quả: Vi khuẩn Gram+ vẫn giữ màu tím; vi khuẩn Gram- bị mất màu và trở nên không màu.

  • Bước 4: Nhuộm bổ sung

    • Phủ dung dịch Safranin lên tiêu bản, để yên trong 30 giây đến 1 phút.

    • Rửa sạch bằng nước cất, thấm khô bằng giấy thấm.

    • Kết quả: Vi khuẩn Gram- ăn màu đỏ; vi khuẩn Gram+ vẫn giữ màu tím ban đầu.

ĐỌC KẾT QUẢ DƯỚI KÍNH HIỂN VI (VẬT KÍNH 100X)

Sinh viên quan sát và ghi chép vào phiếu thực hành:

  1. Màu tím: Vi khuẩn Gram dương (Ví dụ: Staphylococcus aureus, Bacillus...).

  2. Màu hồng/đỏ: Vi khuẩn Gram âm (Ví dụ: E. coli, Salmonella...).

Lưu ý của giảng viên: * Nếu tẩy cồn quá lâu, vi khuẩn Gram+ cũng sẽ mất màu và trông như Gram- (âm tính giả).

  • Nếu tẩy cồn chưa đủ, vi khuẩn Gram- vẫn giữ màu tím (dương tính giả).

  • Nên dùng khuẩn lạc trẻ (18-24 giờ) để có kết quả nhuộm chính xác nhất.