BÀI 5: PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ CHUẨN BỊ DỤNG CỤ

1. Chuẩn bị dụng cụ

Dụng cụ trong vi sinh vật học phải được làm sạch hóa học và tiệt trùng tuyệt đối trước khi sử dụng.

• Rửa dụng cụ: Dụng cụ thủy tinh (đĩa Petri, ống nghiệm, bình tam giác) phải được rửa sạch bằng xà phòng, tráng lại bằng nước cất và để khô.

• Bao gói dụng cụ:

  • Đĩa Petri: Xếp thành cọc (khoảng 5-10 đĩa) rồi bọc kín bằng giấy báo hoặc cho vào ống nhôm.

  • Ống nghiệm/Bình tam giác: Đậy bằng nút bông có quấn gạc (nút bông phải chặt vừa phải để khi nhấc lên không rơi nhưng không quá khít để khí vẫn lưu thông).

  • Pipette: Nhồi một ít bông vào đầu trên và bọc trong giấy kín.

• Tiệt trùng: Cho toàn bộ dụng cụ đã bọc kín vào tủ sấy ở $160-180^{\circ}C$ trong 2 giờ.

2. Pha chế môi trường dinh dưỡng

2.1. Môi trường dinh dưỡng (Culture Medium)

Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp các chất cần thiết giúp vi sinh vật sinh trưởng và phát triển trong điều kiện nhân tạo.

• Phân loại theo trạng thái vật lý:

  • Môi trường lỏng (Broth): Không có chất làm đông đặc (Agar). Dùng để tăng sinh khối.

  • Môi trường đặc (Solid): Chứa 1.5% - 2% Agar. Dùng để phân lập, quan sát hình thái khuẩn lạc.

  • Môi trường bán đặc: Chứa 0.5% - 0.8% Agar. Dùng để kiểm tra khả năng di động.

• Các thành phần cơ bản: Nguồn Carbon (Đường), nguồn Nitơ (Peptone, cao thịt), muối khoáng và các nhân tố tăng trưởng. Hiện nay tại phòng Lab, chúng ta thường dùng môi trường tổng hợp sẵn dạng bột (như PCA, NA, hay môi trường chọn lọc cho nước thải).

2.2. Các bước pha chế môi trường dinh dưỡng vô trùng

Quy trình thực hiện tại phòng thực hành Khoa Công nghệ Hóa - Môi trường:

Bước 1: Tính toán và Cân

• Dựa trên nồng độ ghi trên nhãn hộp môi trường và thể tích cần pha để tính lượng bột chính xác. Cân trên cân phân tích.

Bước 2: Hòa tan

• Cho bột vào nước cất. Đun nhẹ và khuấy đều trên bếp điện/bếp từ để bột tan hoàn toàn (đặc biệt là môi trường có Agar phải đun đến khi dung dịch trong suốt).

Bước 3: Điều chỉnh pH

• Dùng giấy quỳ hoặc máy đo pH để kiểm tra. Thường điều chỉnh về pH = $7.0 \pm 0.2$ bằng dung dịch $NaOH$ 0.1N hoặc $HCl$ 0.1N.

Bước 4: Đóng ống/bình và Tiệt trùng

• Rót môi trường vào các bình tam giác hoặc ống nghiệm.

• Đưa vào nồi hấp tiệt trùng (Autoclave) ở $121^{\circ}C$, áp suất 1 atm trong 15-20 phút.

Bước 5: Đổ đĩa Petri (Trong tủ cấy vô trùng)

• Đợi môi trường nguội xuống khoảng $45-50^{\circ}C$ (cảm giác ấm tay nhưng không bỏng).

• Đốt nhẹ miệng bình tam giác trên đèn cồn.

• Hé nắp đĩa Petri và rót khoảng 15-20ml môi trường vào đĩa.

• Để đĩa nằm yên trên mặt phẳng đến khi thạch đông đặc hoàn toàn.

LƯU Ý KỸ THUẬT (Dành cho sinh viên HueIC)

1. Nút bông: Tuyệt đối không để nút bông bị ướt khi hấp tiệt trùng vì sẽ tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập sau khi lấy ra.

2. Nhiệt độ đổ đĩa: Nếu đổ khi quá nóng, hơi nước sẽ ngưng tụ nhiều trên nắp đĩa. Nếu quá nguội, thạch sẽ bị vón cục (đóng bánh) không đổ được.

3. Bảo quản: Các đĩa thạch sau khi đông nên được lật ngược lại và bảo quản trong tủ lạnh ($4-10^{\circ}C$) để tránh khô thạch và tích tụ nước mặt.